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摘要：【目的】比較雌、雄海馬對小鼠抗疲勞和改善記憶障礙的不同作用?！?/span>方法】轉棒實驗檢測小鼠抗疲勞能 力，將小鼠分3組，1組喂食普通飼料，另外2組分別喂食含有質量分數(shù)0.22%雌、雄海馬的飼料，共喂食6周。 跳臺實驗檢測小鼠記憶能力，將小鼠為4組，正常組與乙醇組喂食普通飼料，另外2組分別喂食含有質量分數(shù)0.22% 雌、雄海馬的飼料，共喂食6周。體積分數(shù)30%乙醇灌胃乙醇組和雌、雄海馬組誘導小鼠記憶損傷模型。【結果】 抗疲勞實驗中，與對照組相比，喂食雄海馬的小鼠在棒時間顯著延長（尸<0.05)，其血清中乳酸含量顯著降低（P <0.05);而喂食雌海馬的小鼠在棒時間和血清乳酸含量均無明顯改變。乙醇記憶損傷實驗中，與對照組相比，模 型組小鼠跳下平臺的潛伏期顯著下降（尸<0.01)，錯誤數(shù)（次）顯著升高（尸<0.01);與模型組相比，喂食雄海 馬的小鼠跳下平臺的潛伏期顯著升高（尸<0.05)，錯誤數(shù)（次）顯著減少（尸<0.05)，腦組織中的乙酰膽堿酯酶 活性顯著降低（尸<0.05);而喂食雌海馬的小鼠上述指標均無改變。【結論】在增強小鼠抗疲勞能力和改善記憶方 面，雄海馬的功效顯著而雌海馬無效。
關鍵詞：雌、雄海馬；抗疲勞；gai善記憶
隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，疲勞的產生對人們 生活質量產生了越來越大的影響。延緩疲勞發(fā)生， 迅速消除疲勞，對人們身體健康極為重要[1]。學習 記憶是大腦重要功能之一，也是人類賴以生存和進 化的關鍵。由外力、環(huán)境污染以及酒精等引起的記 憶損傷，特別是因酒精引起的記憶損害越來越多， 會嚴重危及人類的正常生活工作，造成嚴重經(jīng)濟負 擔。由于海洋的*環(huán)境，許多海洋藥物具有 的活性和特殊的藥理作用機制，在抗疲勞和記憶改 善方面的作用日益受到人們的重視[2]。
海馬入藥歷史悠久，藥理作用廣泛，除性激素 樣作用[3-4]外，還具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲勞和抗 癌[6]、抗抑郁[7]等作用。三斑海馬能顯著延長小鼠 負重游泳時間，減少運動過后的乳酸生成并加速乳 酸代謝，其抗疲勞效果優(yōu)于人參[8]。“深海龍”是一 種含有海馬有效成分的水丸，服用后能顯著提高人 體無氧功率、定量負荷以及極限負荷工作能力[9]。 藥理研究發(fā)現(xiàn)海馬水、醇提取物能在一定程度上改 善記憶[10]。小鼠妊娠晚期，一次性灌胃谷氨酸單鈉， 可明顯降低60日齡仔鼠Y迷宮學習記憶能力[11]。 從三斑海馬中分離出的一種肽類初制劑，可拮抗谷 氨酸單鈉的上述作用[12]。三斑海馬中分離出的一種 小分子多肽能抵抗Ap誘導的神經(jīng)毒性，有望治療 老年癡呆[13]。此外，海馬富含DHA、EPA①-3多不 飽和脂肪酸對大腦有很好保護作用的成分[14]。
目前對《中國藥典》2015版收錄的5種高藥用 價值海馬的研究，主要是三斑海馬，但三斑海馬養(yǎng) 殖較為困難，難以滿足市場需求。而線紋海馬因抗 病能力強、存活率高、生長速率快優(yōu)點[15]，成為近 年來的養(yǎng)殖shou選。同時線紋海馬較三斑海馬異亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高，這些成 分對維護機體健康，增強免疫力有重要作用[16]。目 前關于線紋海馬的研究主要集中在抗炎[17]方面，且 傳統(tǒng)中藥習慣將線紋海馬雌雄配對入藥[18]，單雄性 或單雌性海馬功效研究尚未見報道。本研究以單雌 性和單雄性海馬飼喂小鼠，利用轉棒實驗和急性乙 醇記憶損傷模型，分析雌、雄海馬對小鼠增強疲勞 耐受和改善記憶的功效，并通過測定血清中乳酸 (LA)含量反映小鼠疲勞程度，腦組織中乙酰膽堿 酯酶（AChE)以及乙酰膽堿轉移酶（ChAT)活性 反映小鼠與學習記憶有關的膽堿能系統(tǒng)變化，以期 進一步闡明線紋海馬功效的機制，為線紋海馬保健 品和藥品開發(fā)研究提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
無特定病原體（SPF級）六周齡雄性昆明種小 鼠，體質量22?24 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育 有限公司（合格證號：37⑻92⑻008874 )。小鼠飼 養(yǎng)于SPF級動物房，溫度(23±1 )C，濕度(50±10 )%， 12 h光照（7: 00—19:⑻），自由飲食和攝水。小 鼠適應環(huán)境7d后開始實驗，此時小鼠體質量均值 為33 g。線紋雌海馬、線紋雄海馬，由深圳市萬騏 海洋生物科技有限公司提供。YLS-4C轉棒式疲勞 儀，濟南益延科技發(fā)展有限公司；XR-3TB跳臺實 驗系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司；高速冷凍臺 式離心機，Beckman公司；RT-61⑻酶標儀，Rayto
公司。無水乙醇，成都市科龍化工試劑廠。ELISA 試劑盒LA、AChE、ChAT，產品批號分別為 20170705536T、 20170711258T、 20170702163T，由
江蘇雨桐生物科技有限公司提供。海馬飼料由海馬 粉末與普通粉末飼料按比例混合均勻，混合后的飼 料4C下儲存，小鼠食用飼料每天更新，避免海馬 氧化。
1.2萬法
1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3組（《 = 15):對照組飼喂普通飼料，雌海馬組飼喂質量分 數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組飼喂質量分數(shù) 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料，雌海 馬組飼喂質量分數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組 飼喂質量分數(shù)0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 于水，故采取拌飼料喂食的方式，該方法成熟，應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周，記錄初 始體重，之后每周末稱重一次。
1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗，每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上，設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min，時間10 min。如有小鼠中 途掉落，則將小鼠放回轉棒上繼續(xù)適應。正式實驗 中，設定轉速40 r/min，記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。
1.2.3跳臺實驗[21]體積分數(shù)30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組，造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳臺 實驗時，將小鼠放置在平臺上，自由探索試驗箱3 min,后將小鼠放置在箱內銅柵上，銅柵通電(30 mA 恒流）以刺激小鼠找到平臺。24 h后正式測試，記 錄5 mm內小鼠次跳下平臺的時間，即潛伏期， 以及5 mm內小鼠跳下平臺的總數(shù)（次），即錯誤數(shù) (次)。本實驗為一次性測試結果。
1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min后，小鼠斷 頭頸部取血，全血靜置0.5 h，以轉速3⑻0 r/min離 心10 min，保存血清于-80 °C冰箱。跳臺實驗結束 24 h后，小鼠斷頭，迅速將全腦剝離，液氮冷凍后 保存于-80 C冰箱。
1.2.5生化指標測定根據(jù)ELISA試劑盒說明書， 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量，記憶障礙實驗 小鼠全腦AChE和ChAT活性。
1.2.6數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示，SPSS 19 統(tǒng)計分析，Graphpad 作
1.2萬法
1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3組（《 = 15):對照組飼喂普通飼料，雌海馬組飼喂質量分 數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組飼喂質量分數(shù) 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料，雌海 馬組飼喂質量分數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組 飼喂質量分數(shù)0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 于水，故采取拌飼料喂食的方式，該方法成熟，應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周，記錄初 始體重，之后每周末稱重一次。
1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗，每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上，設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min，時間10 min。如有小鼠中 途掉落，則將小鼠放回轉棒上繼續(xù)適應。正式實驗 中，設定轉速40 r/min，記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。
1.2.3跳臺實驗[21]體積分數(shù)30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組，造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳臺 實驗時，將小鼠放置在平臺上，自由探索試驗箱3 min,后將小鼠放置在箱內銅柵上，銅柵通電(30 mA 恒流）以刺激小鼠找到平臺。24 h后正式測試，記 錄5 mm內小鼠次跳下平臺的時間，即潛伏期， 以及5 mm內小鼠跳下平臺的總數(shù)（次），即錯誤數(shù) (次)。本實驗為一次性測試結果。
1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min后，小鼠斷 頭頸部取血，全血靜置0.5 h，以轉速3⑻0 r/min離 心10 min，保存血清于-80 °C冰箱。跳臺實驗結束 24 h后，小鼠斷頭，迅速將全腦剝離，液氮冷凍后 保存于-80 C冰箱。
1.2.5生化指標測定根據(jù)ELISA試劑盒說明書， 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量，記憶障礙實驗 小鼠全腦AChE和ChAT活性。
1.2.6數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示，SPSS 19 統(tǒng)計分析，Graphpad 作
1.2萬法
1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3組（《 = 15):對照組飼喂普通飼料，雌海馬組飼喂質量分 數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組飼喂質量分數(shù) 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料，雌海 馬組飼喂質量分數(shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組 飼喂質量分數(shù)0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 于水，故采取拌飼料喂食的方式，該方法成熟，應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周，記錄初 始體重，之后每周末稱重一次。
1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗，每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上，設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min，時間10 min。如有小鼠中 途掉落，則將小鼠放回轉棒上繼續(xù)適應。正式實驗 中，設定轉速40 r/min，記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。
1.2.3跳臺實驗[21]體積分數(shù)30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組，造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳臺 實驗時，將小鼠放置在平臺上，自由探索試驗箱3 min,后將小鼠放置在箱內銅柵上，銅柵通電(30 mA 恒流）以刺激小鼠找到平臺。24 h后正式測試，記 錄5 mm內小鼠次跳下平臺的時間，即潛伏期， 以及5 mm內小鼠跳下平臺的總數(shù)（次），即錯誤數(shù) (次)。本實驗為一次性測試結果。
1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min后，小鼠斷 頭頸部取血，全血靜置0.5 h，以轉速3⑻0 r/min離 心10 min，保存血清于-80 °C冰箱。跳臺實驗結束 24 h后，小鼠斷頭，迅速將全腦剝離，液氮冷凍后 保存于-80 C冰箱。
1.2.5生化指標測定根據(jù)ELISA試劑盒說明書， 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量，記憶障礙實驗 小鼠全腦AChE和ChAT活性。
1.2.6數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示，SPSS 19 統(tǒng)計分析，Graphpad 作
圖。參數(shù)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，進行LSD檢 驗，非參數(shù)數(shù)據(jù)（跳臺潛伏期和抗疲勞行為實驗） 均米用 Kruskal-Wallis 分析，進行 Wilcoxon- Mann-Whitney U-test檢驗。所有檢測指標《 = 15。
2實驗結果
2.1雌、雄海馬對小鼠體質量影響
圖1可知，實驗前，各組小鼠體質量沒有差異 (P>0.05)。飼養(yǎng)6周后，各組小鼠的體質量均有 增加，但與對照組相比，飼喂雌、雄海馬的小鼠體 質量均無顯著差異（戶>0.05)，說明雌、雄海馬對 小鼠的正常生長并無影響。
2.2雌、雄海馬飼喂對小鼠抗疲勞耐受時間影響
小鼠從開始到掉棒的持續(xù)時間越長，表示小鼠 耐受時間越長，抗疲勞能力越強。圖2顯示，與對 照組相比，雌海馬組的耐受時間無顯著差異（戶> 0.05 )，雄海馬組的耐受時間則顯著升高（丑 =7.353, P<0.05 )，說明僅雄海馬能增強小鼠抗疲勞能力。
2.3雌、雄海馬飼喂對小鼠血清中乳酸LA影響
圖3顯示，雄海馬對血清乳酸水平有顯著效果 (F(2,42)=3.465, P<0.05)。與對照組相比，雌海 馬組的血清LA水平無顯著差異（P>0.05 )，雄海 馬組的血清LA水平則顯著降低（P<0.05 );與雌 海馬組相比，雄海馬組的血清LA水平也顯著降低 (P<0.05)結果表明雄海馬能有效降低運動疲勞 后小鼠體內LA含量。
2.4雌、雄海馬對小鼠跳臺潛伏期和錯誤數(shù)（次） 影響
圖4顯示，雄海馬對乙醇誘導的跳臺潛伏期有 顯著改善效果（萬=29.364, P<0.01)。與對照組相 比，乙醇組的潛伏期顯著降低（P<0.01);與乙醇 組相比，雌海馬組的潛伏期無明顯升高（P>0.05)， 雄海馬組的潛伏期則顯著升高(P<0.01 )。表明30% 乙醇灌胃能造成小鼠記憶損傷，雄海馬能顯著改善 這種記憶障礙，而雌海馬無效。
4雌、雄海馬對小鼠跳臺潛伏期的影響 Effect of female and male sea horse on step-down latency in mice
圖5顯示，海馬對乙醇誘導的跳臺錯誤數(shù)（次) 有顯著改善效果（F(3,56)=12.315, P<0.01)。與對 照組相比，乙醇組的錯誤數(shù)（次）顯著升高（P< 0.01 );與乙醇組相比，雌、雄海馬組的錯誤數(shù)（次) 均顯著降低（P<0.05)。表明對于乙醇造成的記憶 損傷，雌、雄海馬能部分進行改善。
**, VS 對照組 P<0.01; #, VS 乙醇組 P<0.05
**, VS control group P<0.01; #, VS female sea horse group P<0.05
圖5雌、雄海馬對小鼠跳臺錯誤數(shù)（次）的影口向
Fig. 5 Effect of female and male sea horse on the number of
errors in step-down test in mice
2.5雌、雄海馬對小鼠腦內乙酰膽堿酯酶AChE和 乙酰膽堿轉移酶ChAT活性影響
圖6顯示，海馬對乙醇誘導的AChE活性有顯 著改善效果（F(3,56)=13.5 3 5, P<0.05)。與對照組 相比，乙醇組AChE活性顯著升高（P<0.01);與 乙醇組相比，雄海馬組AChE活性顯著降低（P< 0.05)。結果表明，乙醇能導致小鼠腦內AChE活性 上升，雄海馬能逆轉這一影響
圖6雌、雄海馬對小鼠腦內乙酰膽堿酯酶活性的影響
Fig. 6 Effect of female and male sea horse on the brain
activity of AChE in mice
圖7顯示，與對照組相比，乙醇誘導使得腦內 ChAT 活性顯著降低（F(3,56) =5.656,尸<0.05);但 是與乙醇組相比，雌、雄海馬兩個組ChAT活性均 沒有變化（尸>0.05)。結果表明，乙醇造成的記憶 損傷會使腦內ChAT活性下降，但是雌、雄海馬對 這一變化并無改善作用。
3討論
運動耐力是反映機體疲勞直jie客觀的指標， 運動耐力的增強是抗疲勞能力增強的有力表現(xiàn)。 小鼠轉棒實驗是一種強迫全身消耗性實驗，其運動 時間的長短是衡量疲勞的一個指標[22]。乳酸是機體 在無氧條件下進行糖代謝的終產物，劇烈運動時機 體會產生大量乳酸，乳酸的積累會導致機體疲勞， 可反映機體疲勞程度[23]。在本研究中，雄海馬表現(xiàn) 出對血乳酸的清除作用，提高了機體對氧的利用能 力，降低了無氧酵解程度，從而延長了小鼠運動耐 受時間。彭汶鐸等[24]也發(fā)現(xiàn)小鼠連續(xù)14 d灌胃海馬 酶解提取物，在一次性運動和遞增運動量疲勞模型 中，小鼠血清中乳酸含量均顯著降低。但是飼喂雌 海馬的小鼠，其耐受時間與血清乳酸含量與對照組 相比，并無明顯變化，證明單獨的雌海馬不能改善 小鼠的運動機能，沒有抗疲勞作用。
跳臺實驗是檢測動物學習記憶能力的常用方 法，跳臺潛伏期和錯誤數(shù)（次）是評價動物學習記 憶的重要指標。潛伏期長，錯誤數(shù)（次）少，表明 動物的學習記憶能力強。本研究中，30°%乙醇灌胃 對小鼠的學習記憶能力造成了損傷。一次性飲人過量乙醇，能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)由興奮轉為抑制狀 態(tài)，首先作用于大腦皮層，然后累及皮層下中樞和 小腦，導致記憶力下降[25]。乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 損傷機制比較復雜，其中之一是對膽堿能系統(tǒng)的影 響[26]。而中樞膽堿能系統(tǒng)則與學習記憶密相關，膽 堿能系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質乙酰膽堿（ACh)，其釋放 量隨著學習與記憶、探究行為等認知活動的發(fā)生而 隨之改變。ChAT對ACh的合成起著催化作用，而 AChE則參與腦內ACh的分解，使神經(jīng)遞質對突觸 后膜的興奮作用終止，保證神經(jīng)傳遞正常。在大腦 內，ChAT和AChE共同維持著ACh的動態(tài)平衡[27]。 由于ACh性質極不穩(wěn)定，容易水解，故通過檢測 ChAT和AChE的活性間接來反映ACh的含量。從 實驗結果可知，乙醇組ChAT活性降低，AChE活 性升高，即ACh分解加快而合成減少，AChE總體 水平降低，學習記憶受損。從行為上看，飼喂雄海 馬的小鼠其學習記憶有所改善，潛伏期增加，錯誤 數(shù)（次）減少；而飼喂雌海馬的小鼠，學習記憶能 力并未改善。生化指標則顯示，飼喂雄海馬的小鼠 其腦內AChE活性與乙醇組相比顯著降低，ChAT 活性則無明顯變化，提示雄海馬對學習記憶的改善 可能是通過抑制ACh分解而非加速其合成，此外在 不同記憶損傷模型小鼠中，利用不同中藥如夏天無 和刺五加，均顯示可通過抑制AChE來達到記憶改 善的效果[28-29];由于雌海馬未能改善乙醇造成的學 習記憶損傷，所以與乙醇組相比，飼喂雌海馬的小 鼠其腦內ChAT和AChE活性也無改變。
本研究存在以下兩點不足：1.評價抗疲勞經(jīng)典 藥效學實驗有轉棒疲勞和負重游泳，評價記憶改善 的有跳臺，避暗及水迷宮實驗。目前本實驗只各米 用了其中一種方法。2.實驗中所用海馬為粉末粗材 料，應該找出其中的有效成分進行實驗。接下來筆 者及研究團隊將對雌、雄海馬成分進行更深人的分 析，優(yōu)化海馬提取物，完善實驗方案，為更準確、 更好地利用海馬資源提供理論依據(jù)。
4結論
雄海馬可以通過降低體內乳酸含量，增強小鼠 的抗疲勞能力；通過抑制乙酰膽堿酯酶，改善小鼠 的學習記憶能力；而單獨的雌海馬則沒有上述功 能。雄海馬在抗疲勞和改善記憶方面的*而 雌海馬無效。
