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鈣離子成像
光遺傳學(xué)應(yīng)用以及成果不僅得益于其核心技 術(shù) ( 微生物視蛋白變體、視蛋白靶向策略、光靶向裝置 ) 的發(fā)展，也得益于與輔助技術(shù)的整合，涉及電生理學(xué)、神經(jīng)元活動成像等數(shù)據(jù)讀取，這樣的整合方式賦予了光遺傳學(xué)在不同時(shí)間尺度、不同空間尺度上發(fā)揮功能的優(yōu)勢。
近年來，鈣離子成像與熒光顯微技術(shù)作為新興的腦活動呈現(xiàn)技術(shù)得到了快速發(fā)展。神經(jīng)元鈣離子成像是目前腦功能研究中觀察神經(jīng)元以及神經(jīng)環(huán)路活動監(jiān)測的Z常用手段之一。其原理是神經(jīng)元激活伴隨著鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，與鈣離子指示劑結(jié)合會出現(xiàn)熒光強(qiáng)度的改變，從而體現(xiàn)神經(jīng)活動變化，對神經(jīng)活動可進(jìn)行長達(dá)數(shù)月的監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)長期體內(nèi)神經(jīng)元成像。鈣離子指示劑是目前Z常用的基因編輯熒光指示劑，來自于綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 或其變異體、鈣調(diào)蛋白 (calmodulin， CaM)、肌球蛋白輕鏈激酶 M13 域的融合，其中鈣指示劑 GCaMP6 由于*的敏感度，廣泛應(yīng)用于在體成像研究中。光遺傳集成顯微系統(tǒng)，整合了光遺傳學(xué)與鈣成像技術(shù)，利用單光子成像技術(shù)，使用 LED作為光源，將梯度折射率透鏡 (gradient refractive index，GRIN) 作為物鏡。這種集成顯微鏡可以在自由活動的老鼠中實(shí)現(xiàn)高速大規(guī)?？v向記錄特定神經(jīng)元群體的鈣離子動態(tài)，從而反映神經(jīng)元與神經(jīng)環(huán)路的活動情況。
新一代光遺傳學(xué)技術(shù)達(dá)到了目前研究所需要的高時(shí)間、空間、細(xì)胞類型分辨率，具備單個(gè)神經(jīng)元與神經(jīng)纖維分辨率的神經(jīng)元群體的長期監(jiān)測能力 ( 表 1) 。
自由活動神經(jīng)元超微鈣離子成像系統(tǒng) nVista 和 結(jié)合光遺傳自由活動神經(jīng)元超微鈣離子成像系統(tǒng)nVoke 是目前Z先進(jìn)的光遺傳集成顯微系統(tǒng)，在神經(jīng)環(huán)路疾病的研究上具有很大的優(yōu)勢。上述集成系統(tǒng)能夠整合光遺傳學(xué)調(diào)控和實(shí)時(shí)鈣離子成像，通過微型植入式探頭，在自由活動的動物上長期觀察特定神經(jīng)元群體與腦環(huán)路的神經(jīng)活動，可以實(shí)現(xiàn)自動聚焦、精準(zhǔn)定位任意目標(biāo)區(qū)域、無需手工調(diào)整，最終將同時(shí)段的行為學(xué)記錄、電生理信息、鈣離子成像等進(jìn)行多模態(tài)整合，對于參與特定腦疾病神經(jīng)環(huán)路中的細(xì)胞進(jìn)行解析，繪制環(huán)路細(xì)胞類型與功能圖譜，解釋特定腦疾病的潛在發(fā)病機(jī)制。
功能和用途
1、功能：本儀器是基于多模光纖的微弱熒光信號檢測和記錄系統(tǒng)，能夠穩(wěn)長時(shí)間穩(wěn)定的激發(fā)綠色熒光，并檢測熒光信號的微弱變換。
2、用途：用于在體記錄動物群體神經(jīng)元活動鈣信號的動態(tài)變化，主要用途和特點(diǎn)如下：
通過光學(xué)記錄通過遺傳手段所確定的特定細(xì)胞類型在自然狀態(tài)下的神經(jīng)活動；
實(shí)時(shí)觀測動物在進(jìn)行復(fù)雜行為時(shí)的神經(jīng)投射活動；
闡明特殊的神經(jīng)環(huán)路在動物行為中的作用；
檢測新型可遺傳編碼的乙酰膽堿和多巴胺等探針的熒光變化，即可實(shí)時(shí)監(jiān)測乙酰膽堿、多巴胺等濃度的動態(tài)變化情況；
通過直接觀測和投射相關(guān)的活動從而在根本上了解以前不可能接觸到的神經(jīng)環(huán)路的動態(tài)行為；
光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
光遺傳學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在神經(jīng)元的快速精準(zhǔn)控制以及數(shù)據(jù)讀取，極大程度上促進(jìn)了神經(jīng)科學(xué)發(fā)展， 幫助業(yè)內(nèi)學(xué)者了解更復(fù)雜的神經(jīng)過程(如學(xué)習(xí)、睡眠、視覺、成癮、運(yùn)動，等 )，對于腦疾病中神經(jīng)環(huán)路的解析具有重要意義，并且有望用于尋找各種神經(jīng)疾病治療的新靶點(diǎn)。
腦疾病神經(jīng)環(huán)路研究 神經(jīng)環(huán)路是由一系列相聯(lián)系的神經(jīng)元構(gòu)成的具有明確功能的神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系，是大腦神經(jīng)系統(tǒng)的基本單元。對于腦疾病的理解可以來自于多個(gè)層面，從細(xì)胞分子水平的微觀水平到動物行為的宏觀水平，前期的研究主要集中在微觀細(xì)胞分子水平與宏觀動物行為水平。以神經(jīng)環(huán)路為基礎(chǔ)的腦功能連接組圖譜，對于理解腦功能意義重大，要提高對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認(rèn)識，目前急需的是識別潛在的神經(jīng)環(huán)路的異常。腦疾病如阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓病 (Huntington’s disease，HD)、癲 等所發(fā)生的病理生理變化會影響 正常神經(jīng)環(huán)路的功能，產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀，了解其神經(jīng)環(huán)路的異常變化是理解疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找相應(yīng)治療方案的必經(jīng)途徑 。
AD
AD是老年人中最常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，進(jìn)行性記憶衰退是疾病特征，患者隨后認(rèn) 知損害更廣泛，顯著受影響的是學(xué)習(xí)與記憶神經(jīng)環(huán)路。目前，海馬區(qū)域的神經(jīng)環(huán)路以及其與前額葉皮質(zhì)區(qū)相互聯(lián)系是被廣泛研究的腦區(qū)域。海馬結(jié)構(gòu)與前額葉皮質(zhì)以雙向方式相互作用，調(diào)節(jié)多種認(rèn)知功能以及處理情緒信息，是大腦記憶系統(tǒng)中極為重要的結(jié)構(gòu)，有助于新信息的快速編碼、記憶網(wǎng)絡(luò)的整合、檢索與組織。
發(fā)作性記憶進(jìn)行性喪失是 AD 早期的常見癥狀，大腦中記憶儲存在一群特定神經(jīng)元 —— 海馬印跡細(xì)胞中。AD 早期的記憶衰退的機(jī)制并不明確，可能是信息編碼與整合或是存儲與檢索神經(jīng)環(huán)路受損。利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)印跡細(xì)胞傾向于通過重復(fù)性活動以同步、協(xié)調(diào)的方式進(jìn)行工作，不同群體的印跡細(xì)胞組成不同類型的同步性活動呈現(xiàn)記憶( 圖 3)。通過對 AD 早期轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)印跡與非印跡細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間的區(qū)分、監(jiān)測和調(diào)控，發(fā)現(xiàn)激活海馬印跡細(xì)胞可以促使記憶恢復(fù)，說明 AD記憶損傷是由于記憶檢索提取相關(guān)神經(jīng)環(huán)路受損所致，而不是記憶存儲的損傷所致。
利用 AD 小鼠模型，研究人員發(fā)現(xiàn)在 AD 典型病理變化 β 淀粉樣斑塊沉積產(chǎn)生之前，小鼠的遺忘呈現(xiàn)出年齡依賴性，與海馬齒狀回的棘突密度有關(guān)。利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)長期刺激齒狀回神經(jīng)元，通過誘導(dǎo)齒狀回印跡細(xì)胞產(chǎn)生長時(shí)程增強(qiáng)，促進(jìn)棘突密度以及長期記憶的恢復(fù)，并且去除這部分印跡細(xì)胞可以阻止長期記憶的恢復(fù)，提示 AD 早期選擇性的挽救恢復(fù)印跡細(xì)胞的棘突密度可能是治療記憶喪失的有效靶點(diǎn)。
PD
PD 是一種神經(jīng)退行性疾病，中腦黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元逐漸死亡是 其病理特征。PD 的主要癥狀是運(yùn)動障礙，包括靜止性震顫、肌肉僵硬和運(yùn)動無力。典型發(fā)病機(jī)制是紋狀體功能失調(diào)，直接與間接通路功能失衡所致 ( 圖4)。涉及的主要神經(jīng)元為中間棘狀神經(jīng)元 (medium spiny neuron，MSN)，主要表達(dá)多巴胺 D1 和 D2 兩種受體。光遺傳學(xué)研究提供了紋狀體 MSN、中間神經(jīng)元和傳入神經(jīng)元的詳細(xì)信息，從而對于 PD 的基 本病理做出了解析。光遺傳學(xué)在 PD 的運(yùn)動功能、多巴胺能神經(jīng)元移植、病理環(huán)路研究上得到較多應(yīng)用，特別是 PD 環(huán)路功能失調(diào)，是目前的研究熱門領(lǐng)域，近年獲得了眾多進(jìn)展 ( 表 2)。
癲 癲
是一種由于神經(jīng)元高興奮性引起的神經(jīng)環(huán)路興奮性異常增高，從而出現(xiàn)癲 發(fā)作為特征的疾病。以往用于解析癲 神經(jīng)環(huán)路異常的方法包括藥物刺激和光刺激釋放，這些方法受限于時(shí)間分辨率低以及谷氨酸補(bǔ)給。研究人員利用光遺傳技術(shù)的高時(shí)間與空間分辨率對以往存在質(zhì)疑的失神發(fā)作環(huán)路進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元的節(jié)律同步性腦電波發(fā)放以及階段性發(fā)放，對誘發(fā)失神發(fā)作中的同步尖峰放電波以及行為是必需且充分的。癲 發(fā)作嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，造成患者認(rèn)知損害和記憶損傷，前期研究認(rèn)為可能與海馬長期暴露于異常高鈣離子濃度下造成的損傷有關(guān)。常規(guī)技術(shù)無法在哺乳類動物海馬神經(jīng)元觀察其鈣動力學(xué)，利用新一代光遺傳學(xué)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)不僅在癲發(fā)作期間，而且在癲 發(fā)作出現(xiàn)以及 EEG 異常之前，海馬神經(jīng)元的鈣動力學(xué)就出現(xiàn)了明顯異常，這種異常發(fā)現(xiàn)可以促使研究者抓住癲 發(fā)作前的時(shí)機(jī)從而控制癲 發(fā)作。海馬神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子水平顯著高于正常水平，提示鈣興奮性細(xì)胞毒性可能是癲 致認(rèn)知損害的原因。有趣的是常規(guī)抗癲 藥物丙戊酸鈉并未改變在癲 中所觀察到的鈣離子動力學(xué)的異常。未來可以利用大規(guī)模的神經(jīng)元鈣離子成像平臺進(jìn)行新的抗癲藥物篩選，為癲 治療提供新視角。
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