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目的
建立跳臺反射法耳鳴動(dòng)物行為學(xué)模型，豐富動(dòng)物耳鳴的建模方法。
方法
Wistar大鼠20只，隨機(jī)平均分為2組：水楊酸組和對照組（每日分別經(jīng)腹腔注射10 %水楊酸鈉350 mg/kg/天和生理鹽水）。動(dòng)物于隔音室內(nèi)進(jìn)行條件反射訓(xùn)練。經(jīng)10～14天的強(qiáng)化訓(xùn)練后，動(dòng)物形成“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射。條件反射建立后動(dòng)物給藥，分別記錄兩組動(dòng)物在給聲期間及刺激間期跳上跳臺的次數(shù)。結(jié)果 水楊酸組動(dòng)物給藥后每10次刺激間期中出現(xiàn)的跳臺動(dòng)作為（3.9±1.6）次，經(jīng)方差分析，與對照組存在顯著性差異（P<0.05），說明大鼠經(jīng)注射水楊酸鈉后有耳鳴的產(chǎn)生。
結(jié)論
跳臺法耳鳴動(dòng)物模型可有效驗(yàn)證水楊酸動(dòng)物耳鳴的產(chǎn)生，可為耳鳴的基礎(chǔ)研究提供一種理想模型。
耳鳴為耳科常見病，據(jù)英國的一項(xiàng)調(diào)查研究顯示，在成年人中，大約有10％的人曾患有持續(xù)性自發(fā)性耳鳴（prolonged spontaneous tinnitus），其中約1％的患者因嚴(yán)重的耳鳴而產(chǎn)生煩躁、焦慮和抑郁等癥狀，嚴(yán)重影響日常生活和工作。約2.5％的成年人因耳鳴癥狀曾入院治療。長期以來，由于缺少有效的動(dòng)物耳鳴疾病模型，使得人們對耳鳴發(fā)生機(jī)理的研究進(jìn)展緩慢，從而大大制約了耳鳴的治療進(jìn)展。由于動(dòng)物無法像人類那樣通過語言來描述耳鳴的產(chǎn)生，所以建立某種條件反射，通過對動(dòng)物行為的觀察來間接判斷動(dòng)物耳鳴的產(chǎn)生就成為建立耳鳴動(dòng)物模型的基本原理。1988年Jastreboff等通過飲水抑制法，提出了Di一個(gè)經(jīng)典的急性水楊酸鹽耳鳴動(dòng)物模型，使人們能夠深入研究耳鳴的發(fā)生機(jī)制和治療。2003年Guitton等對大鼠耳鳴的研究中利用跳臺反射的方法，通過建立一種“聲音刺激-電擊-逃避反應(yīng)”的行為模式來觀察動(dòng)物耳鳴，同樣也取得了較好的效果。本研究的目的是參考Guitton等的方法并加以適當(dāng)改進(jìn)，建立跳臺法耳鳴動(dòng)物行為學(xué)模型，提供另一種有效的耳鳴建模方法。
1.1 動(dòng)物 健康雄性白色Wistar大鼠20只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。所有動(dòng)物耳道清潔，耳廓反射靈敏，對電刺激反應(yīng)敏感，體重285 g～468 g，平均354 g。
1.2 主要試劑與儀器 水楊酸鈉（sodium salicylate，美國Sigma公司）；屏蔽訓(xùn)練箱（自制）；大鼠跳臺儀（上海欣軟信息科技有限公司，XR-3TD型）；飛樂牌揚(yáng)聲器（YD-2502型，8Ω）；音頻信號發(fā)生器（GW GFG-8016D型）；功率放大器（紅巖牌HY5885A-400型）；示波器（ARON-BS5504型）；力盾牌數(shù)字時(shí)間繼電器（JS48S-S型）。
1.3 方法
1.3.1 動(dòng)物分組 將動(dòng)物平均隨機(jī)分為2組，第1組為水楊酸組，第2組為對照組，每組10只。
1.3.2 建立條件反射 動(dòng)物于隔音室內(nèi)適應(yīng)性分籠喂養(yǎng)，每籠4只。室內(nèi)溫度恒定控制在25℃，人工控制照明12小時(shí)燈光開/關(guān)使動(dòng)物的晝夜節(jié)律保持穩(wěn)定，飲食及飲水充足，一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
條件反射訓(xùn)練于另一隔音室內(nèi)進(jìn)行，各頻率背景噪聲均<25 dB SPL，每只動(dòng)物均單獨(dú)進(jìn)行訓(xùn)練。動(dòng)物置于自制的屏蔽訓(xùn)練箱內(nèi)，箱頂揚(yáng)聲器給予10kHz，60 dB SPL的外界聲刺激作為條件刺激，持續(xù)時(shí)間為10秒，非條件刺激為動(dòng)物足底電擊（5mA），持續(xù)時(shí)間8秒，條件刺激和非條件刺激出現(xiàn)的時(shí)間間隔為2秒。訓(xùn)練動(dòng)物當(dāng)聽到聲刺激信號后，因足底受到電擊而產(chǎn)生向箱內(nèi)絕緣跳臺跳躍的逃避反應(yīng)。每次訓(xùn)練的間隔期為3分鐘。每只動(dòng)物每天連續(xù)訓(xùn)練10次為一個(gè)訓(xùn)練系列。記錄動(dòng)物在給聲期間及刺激間期的行為反應(yīng)，正確反應(yīng)率為給聲期間動(dòng)物正確跳上跳臺的百分率。經(jīng)過4～5天的適應(yīng)性訓(xùn)練，動(dòng)物開始學(xué)會建立“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射，連續(xù)4天未學(xué)會跳臺逃避的動(dòng)物即被淘汰。再經(jīng)過7～10天的強(qiáng)化訓(xùn)練，使此條件反射加強(qiáng)并穩(wěn)定。當(dāng)每只動(dòng)物至少在連續(xù)3個(gè)訓(xùn)練系列中對聲音的正確反應(yīng)率均≥80％，即可判定為條件反射建立成功。
隔音箱+跳臺箱，型號：XR-3TB
1.3.3 行為監(jiān)測 當(dāng)動(dòng)物條件反射建立成功后，即進(jìn)入實(shí)驗(yàn)觀察期，觀察藥物對動(dòng)物行為反應(yīng)的影響。此階段的動(dòng)物行為觀測指標(biāo)為：①正確反應(yīng)率，為外界給聲時(shí)動(dòng)物正確跳上跳臺的百分率；②假陽性反應(yīng)，為每個(gè)訓(xùn)練系列中動(dòng)物在刺激間期的前1分鐘內(nèi)跳上跳臺的次數(shù)。足底電擊只在聲刺激后動(dòng)物未能正確跳上跳臺時(shí)隨機(jī)給予。刺激間期動(dòng)物若在跳臺上停留時(shí)間超過10秒，則人工將動(dòng)物取下。整個(gè)行為監(jiān)測分為3個(gè)階段，給藥前期（1～2天）。給藥期（3～6天）：水楊酸組動(dòng)物每日經(jīng)腹腔注射10％水楊酸鈉350 mg/kg，對照組每日經(jīng)腹腔注射生理鹽水350mg/kg。所有動(dòng)物均連續(xù)給藥4天，并于每次給藥后2小時(shí)進(jìn)行動(dòng)物行為測試，記錄動(dòng)物行為反應(yīng)指標(biāo)的變化。停藥期（7～11天）：兩組動(dòng)物分別停止應(yīng)用水楊酸鈉和生理鹽水，連續(xù)記錄停藥5天的動(dòng)物行為反應(yīng)指標(biāo)。
1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙因素方差分析。第1組動(dòng)物注射水楊酸鈉（3～6天）后2小時(shí)對聲音的正確反應(yīng)率為（86.8±3.3）%，與給藥前相比（91.9±0.8）％，曲線呈輕度下降（P<0.05），停藥后逐漸恢復(fù)至給藥前水平（圖1）。第1組動(dòng)物在給藥期的假陽性反應(yīng)為（3.9±1.6）次，曲線較給藥前上升明顯（圖2）。與對照組動(dòng)物相比，動(dòng)物注射水楊酸后假陽性反應(yīng)明顯增加，經(jīng)方差分析，二者存在顯著性差（P<0.05）。對照組動(dòng)物各期之間的行為學(xué)指標(biāo)無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果證明，水楊酸組動(dòng)物確實(shí)感覺到了耳鳴的存在。在聲刺激的間隔期，盡管沒有外界聲刺激存在，但動(dòng)物因感受到了耳鳴信號，從而誘發(fā)了對電擊的恐懼反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)跳臺動(dòng)作，假陽性反應(yīng)明顯增加。
3. 討論
水楊酸類藥物對人體具有明顯的耳毒性作用，長期大劑量使用會導(dǎo)致耳鳴、聽力下降，停藥后癥狀逐漸消失。臨床觀察聽力正常者長期服用大劑量（>350 mg/kg）水楊酸鹽后，幾乎100%有不同程度耳鳴產(chǎn)生。其血藥濃度于1～1.5小時(shí)后達(dá)峰值。由于水楊酸鹽具有引起耳鳴的成功率高、操作簡單、全身副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因此，經(jīng)水楊酸鹽誘導(dǎo)建立的耳鳴動(dòng)物模型是目前Z常用、有效的建模方法。1994年Jastreboff等利用飲水抑制方法，*成功設(shè)計(jì)出一套完整的經(jīng)水楊酸鹽誘導(dǎo)的動(dòng)物急性耳鳴行為學(xué)模型，并通過試驗(yàn)測得水楊酸鈉引起的耳鳴在聲音特性上與10 kHz，70 dB的純音基本一致。
耳鳴動(dòng)物模型設(shè)計(jì)的基本原理是建立某種與耳鳴信號相關(guān)的條件反射，通過動(dòng)物的行為學(xué)指標(biāo)對動(dòng)物有無耳鳴加以判斷。根據(jù)經(jīng)典條件反射和操作性條件反射的原理，形成條件反射的基本條件就是條件刺激與非條件刺激在時(shí)間上的結(jié)合，這個(gè)過程稱為強(qiáng)化。一般來說，一切來自體內(nèi)外的有效刺激只要跟非條件刺激在時(shí)間上結(jié)合（即強(qiáng)化），都可以成為條件刺激，形成條件反射，例如食物性條件反射、防御性條件反射等?；谝陨显?，2003年Guitton等利用跳臺法建立的耳鳴動(dòng)物模型同樣取得了令人滿意的結(jié)果。本模型通過將“聲刺激”和“電擊-跳臺反應(yīng)”在時(shí)間上進(jìn)行結(jié)合、加強(qiáng)并終使動(dòng)物建立“聲刺激-跳臺逃避行為”的條件反射。條件反射建立后，動(dòng)物對聲音（10 kHz，60 dB SPL）反應(yīng)敏感，并且通過7～10天的條件強(qiáng)化，動(dòng)物對此條件反射的記憶時(shí)間較長，平均在6～7天內(nèi)對聲音的正確反應(yīng)率可維持在80％以上，因此較為適合實(shí)驗(yàn)周期相對較長的耳鳴實(shí)驗(yàn)。另外，與飲水抑制法相比，此模型還具有在實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的全身狀態(tài)影響較小的優(yōu)點(diǎn)，因此較適合應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物身體狀態(tài)有特殊要求的情況，如實(shí)驗(yàn)中對耳鳴動(dòng)物進(jìn)行的手術(shù)干預(yù)等。
本實(shí)驗(yàn)采用Guitton等創(chuàng)立的跳臺法建立耳鳴動(dòng)物模型，并對其訓(xùn)練方法加以如下改進(jìn)：
①針對文獻(xiàn)報(bào)道的條件聲刺激持續(xù)3秒，條件刺激結(jié)束1秒后給予30秒的非條件刺激的方式，考慮到耳鳴為持續(xù)性信號的特點(diǎn)，我們將條件聲刺激增加為10秒，以使外界聲信號與耳鳴的存在形式更為相似。非條件刺激時(shí)間持續(xù)8秒，使動(dòng)物在接受電擊的同時(shí)始終有聲刺激的存在。
②文獻(xiàn)要求在條件刺激結(jié)束1秒后給予非條件刺激，但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物較難在1秒內(nèi)對聲音作出正確反應(yīng)，我們將非條件刺激改為在條件刺激結(jié)束2秒后給予，取得良好效果。
③文獻(xiàn)中每次條件訓(xùn)練的間隔期為1分鐘，我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練間隔期過短往往會造成動(dòng)物對條件反射的過度強(qiáng)化，動(dòng)物在間隔期沒有聲刺激的情況下后仍然出現(xiàn)頻繁的跳臺行為，導(dǎo)致正常狀態(tài)下的假陽性反應(yīng)過高，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對此我們將每次訓(xùn)練的間隔期延長為3分鐘，有效控制了假陽性率的出現(xiàn)。
我們認(rèn)為利用跳臺反射法建立的耳鳴動(dòng)物行為模型具有成功率高、穩(wěn)定且可操作性好的優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于對耳鳴發(fā)生機(jī)制方面的研究。
